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前沿资讯 |用于个性化肺癌治疗的双功能微流体芯片：结合EGFR突变检测和基于类器官的药物反应测试Issuing time:2024-03-27 14:07 大家好!今天为大家分享一篇2024年一月发表在Lab On a Chip上的文章，题目为“A dual-functional microfluidic chip for guiding personalized lung cancer medicine: combining EGFR mutation detection and organoid-based drug response test”北京理工大学魏泽文团队研究开发了一种双功能微流控芯片，将EGFR突变的快速检测和PDOs上抗癌药物的体外检测相结合。本文的通讯作者为北京理工大学魏泽文。 研究背景 肺癌是导致癌症相关死亡的最常见原因，到2020年，预计全球将有超过180万人因肺癌死亡。以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的发展已经改变了非小细胞肺癌（NSCLC）治疗策略，占肺癌病例的85%。检测EGFR突变的存在已成为一种常规的临床检测方法，对指导EGFR特异性TKI的使用起着至关重要的作用。另一方面，许多因素，包括肿瘤内的异质性和肿瘤的进化，可导致对EGFR特异性TKI药物的不同反应。因此，已经开发了多种方法来体外检测EGFR特异性TKI药物的治疗效果。为了提高对NSCLC患者的个性化药物治疗的有效性，人们已经付出了许多努力。为了检测EGFR突变，下一代基于PCR和液滴数字PCR测序（NGS）是目前临床应用最广泛的方法 。然而，NGS仍然昂贵和耗时，通常需要2-4周。延长对NGS结果的等待期可能会提高癌症进展的风险。此外，对于野生型EGFR患者，约占NSCLC总病例的50%，昂贵的测序对药物选择没有帮助。在体外药物反应检测中，随着许多癌症类型的构建、PDOs的操作和鉴定，基于PDO的药物反应检测的准确性和有效性已被许多临床研究证实。即使有微流控结构的帮助下，单个患者培养PDOs的数量仍然有限。考虑到商业ATP检测试剂盒是分析PDOs生长状态最常用的方法，它们都涉及细胞裂解。只有有限的种类，通常是2到24种药物可以在单个患者的PDOs上进行测试。由于个体差异对癌症的影响，患者肿瘤内的异质性是不可避免的，对EGFR突变的分子诊断或基于PDO的抗癌药物反应试验的分离管理可能会导致错过抗癌药物的最佳组合。首先根据分子诊断选择抗癌药物，然后在PDOs上进行体外测试，这可能是确保个体NSCLC患者获得最佳药物的一个很有前途的解决方案。不幸的是，这种策略还有待实现，很可能是由于以下技术瓶颈：1)时间成本：基于NGS的EGFR突变检测和PDOs有限的生存期之间的不匹配。2)在有限数量的PDOs上用尽所有可能的EGFR-TKI和化疗药物的选择是不可行的。 为了解决上述问题，本研究开发了一种双功能微流控芯片，将EGFR突变的快速检测和PDOs上抗癌药物的体外检测相结合。基于双功能微流控芯片，开发了一个实现芯片自动化操作过程的系统。为了在2小时内快速检测EGFR突变的存在，开发了一种基于DNA的纳米标尺（命名为EGFR-DNR）来确定EGFR在细胞表面的空间分布，根据EGFR-DNR的EGFR突变检测结果，PDOs均采用EGFRTKI或化疗药物。此外开发了一种基于DNA的检测的ATA纳米传感器（称为ATP-DNS），用于原位监测PDOs生长状态的整个过程。该双功能微流控芯片集成上述所有需要的程序，消除人为误差/样品损失，提高数据可重复性。这种双功能微流控芯片已通过细胞系和临床样本进行了验证。 图文导读 在双功能微流控芯片中结合快速EGFR突变检测和药物反应测试：图1展示了一种个性化肺癌药物筛选方案，在单个微流控芯片中完成的两步实验。将癌细胞从肿瘤组织中分离出来，分为两部分。第一步是在2小时内快速检测到EGFR突变的存在。少量细胞被捕获为单细胞，然后在微流控芯片中用识别EGFR的染色EGFR-DNR来确定EGFR在肺癌细胞上的空间分布。在癌细胞系和临床样本上的实验结果表明，与野生型EGFR细胞相比，突变的EGFR细胞的EGFR间距更窄。因此，与测序技术相比，EGFR-DNR能够检测到EGFR突变的存在，并将检测周期从数周缩短到数小时。因此，EGFR-DNR的使用创造了一种从患者身上提取的有限数量的抗癌药物的可能性，无论是EGFR-TKIs或化疗药物。在步骤2中，分离后的癌细胞在微流控芯片中培养，在18个腔室中形成癌症PDOs。根据步骤1的检测结果，将EGFR-TKIs或化疗药物通过比例混合器注射到类器官腔室中，用基于DNA的纳米传感器检测（ATP-DNS），监测PDOs的全过程生长状态。ATP-DNS具有ATP识别的高灵敏度/特异性和低细胞毒性，因此首次成功地尝试全程监测脆弱PDOs中的ATP变化，以分析其生长状态曲线。  图1：双功能微流控芯片中快速EGFR突变检测和药物反应测试的示意图。 图2展示了双功能微流控芯片的设计和制造，以及用于快速检测EGFR突变和全程监测类器官药物反应的自动化系统（命名为RDMOChip，RDMO-System）。如图所示，RDMO-System由一个运行在智能手机上的专门设计的软件来控制。RDMO-System的组装方式和照片如图2a和b所示。RDMO-System的尺寸为33厘米，27厘米宽度，高18厘米。首先通过智能手机和RDMO系统之间的蓝牙连接接收，然后由控制电路执行，该控制电路依次激活气体/流体控制，以执行RDMOChip中的操作过程。RDMO-System由一个高容量的电池供电，并在整个运行期间被放置在一个电池培养箱中。为了保证流体/气体的稳定流动，简化更换RDMO-Chip的程序，设计了一个钳位作为芯片接口。RDMO-Chip由3层组成，分别为药物/培养基注射层、细胞/类器官处理层和玻璃基板。细胞/类器官处理层被设计用于捕获/染色单个癌细胞以检测EGFR突变，以及培养/监测类器官以检测药物反应。药物/培养基注射层旨在提供必要的营养物质或选定的抗癌药物。从功能的角度来看，RDMO-Chip分为3个模块： EGFR突变检测模块、类器官分析模块和药物注射模块。所有需要的程序，包括EGFR突变检测和基于PDO的药物反应测试，都在一个芯片中完成，避免了丢失宝贵临床样本的可能，消除了人为错误，提高了实验的可重复性。为了保证临床样本的新鲜度，避免临床样本的丢失，EGFR突变检测和PDO培养的步骤在双功能微流控芯片中进行同步。RDMO-Chip的操作包括以下两个步骤： (1) EGFR突变检测。将从肿瘤组织中分离出来的悬浮细胞注射到RDMO-Chip和指向一个由600个细胞组成的细胞捕获通道单细胞捕获位点，捕获效率达到93%。然后是在300个捕获位点上的细胞用一种EGFR-DNR染色，其余300个捕获位点的细胞用另一种EGFRDNR染色。通过比较细胞荧光的差异，检测到EGFR突变的存在。(2)对类器官的药物反应试验。2小时后，癌细胞和ECM被引导到18个培养室（6个平行通道，每个通道3个培养室）。培养基从上层药物/培养基注射层，通过穿孔膜提供。培养7-10天后，建立PDOs。然后将抗癌药物注射到类器官室中，与培养基共享相同的流动路线。对于野生型EGFR患者，将化疗药物加入类器官腔室；对于携带EGFR突变的患者，加入EGFR-TKIs。设计了一个比例混合器来模拟药物组合的实际临床实验。加入抗癌药物3天后，将ATP-DNS加入类器官室，与培养基共享相同的流动路线。ATP-DNS会识别细胞间的ATP，然后发出红色荧光。此外，ATP-DNS也不会损害PDOs的生存能力。  图2 ：RDMO芯片和RDMO系统的设计和表征。 通过EGFR-DNR快速检测EGFR突变的存在：在现有的基于PDO的抗癌药物反应试验中，来自单个患者的有限数量的PDOs和相对较大的候选药物数量之间存在着不可避免的矛盾。更好的解决方案是在肺癌患者身上测试EGFR-TKI或化疗药物，而不是同时测试。然而，基于NGS的测序成本为2-3周，这对于PDO检测是不可接受的延迟。EGFR突变与EGFR蛋白的空间分布之间有很强的相关性。设计并合成了一种基于DNA的EGFR识别纳米仪（EGFR-DNR），用于准确分析EGFR蛋白的空间分布，推断出EGFR突变的存在。这个过程将在2小时内完成。图3的方案是EGFR-DNR的建设。采用M13mp18单链DNA（M13mp18 ssDNA）作为支架结构。通过互补碱基配对，折叠的M13mp18 ssDNA被短钉链固定，形成三层矩形DNA纳米结构。三层矩形DNA纳米结构包含149条短链和9条特殊的短链。149条短链被设计成包含构象，而9条特殊的短链被polyA延伸，用于连接EGF分子。通过视觉分子动力学（VMD）观察了EGFRDNR-25和EGFR-DNR-100的构型，发现所有红色链都向外定向，确保了与EGF分子的连接。通过透射电镜检测了EGFR-DNR-25和EGFR-DNR-100的结构完整性。证明了这个长度其宽度分别为100 nm和17 nm。用莫尔文分析仪测定了EGFRDNR-25和EGFR-DNR-100的流体力尺寸。说明它们的峰值都在100 nm左右。这些结果表明，EGFR-DNR-25和EGFR-DNR-100的构造尺寸相似。因此，以上结果说明，EGFR-DNR-25和GFRDNR-100的设计和合成为三层矩形，长度100 nm，宽度17 nm，水动力尺寸为100 nm。由于EGF分子特异性地与EGFR蛋白结合，且相邻EGF分子之间的间距由DNA纳米结构固定，因此EGFR-DNR可以识别具有不同空间分布的膜蛋白EGFR。用A549（野生型EGFR）和H1975（突变型EGFR： L858R和T790M）细胞系来验证其能力EGFR-DNR研究如何识别EGFR的空间分布和相应的EGFR突变状态。A549和H1975细胞与EGFR-DNR孵育2小时，并用共聚焦显微镜成像。 EGFR - DNR -25和EGFR-DNR-100均与A549和H1975细胞结合，但表现出不同强度的绿色荧光。荧光强度通过ImageJ进行量化。A549细胞（野生型EGFR）的EGFR-DNR-25/EGFR-DNR100的值小于1.0；而H1975细胞量化值较大均大于1.0。除了细胞系水平的检测，临床样本，编号从1到4，也被用于验证EGFRDNR。从临床组织样本中分离出来的细胞与等摩尔的EGFR-DNR-25和EGFRDNR-100孵育2小时，并通过共聚焦显微镜成像。对于临床样本1，EGFRDNR-25/EGFR-DNR-100的值小于1.0，说明为野生型EGFR；对于临床样本2-4，EGFR-DNR25/EGFR-DNR-100的值大于1.0，表示EGFR突变。此项由EGFR-DNR的检查结果完全匹配来自临床EGFR突变检测的结果。结果从2个细胞系和4个临床样本中发现，与野生型EGFR细胞相比，突变的EGFR细胞的膜蛋白EGFR的空间间距更窄。因此，EGFRDNR能够描述EGFR的空间分布与EGFR突变之间的关系。基于这种结构，通过对捕获细胞进行染色和成像，RDMO-Chip可以快速检测EGFR突变的存在。  图3：EGFR-DNR的表征和功能验证。 通过ATP-DNS监测ATP的变化，以分析细胞的生长状态：因为三磷酸腺苷（ATP）不仅能动态地调节细胞活力和代谢活性，对药物诱导的细胞凋亡也表现出很高的敏感性，检测ATP变异已成为表征PDOs生长状态的常规检测方法。然而，商业ATP检测试剂盒不适用于微流控芯片中的原位监测，因为这些试剂盒都涉及细胞裂解。在本研究中，开发了一种DNA纳米传感器（ATP-DNS），可以在不损害细胞活力的情况下识别细胞内ATP的变化，实现对PDOs整个过程生长状态的原位监测。图4显示了ATP-DNS的构建，它是由一个四面体的DNA框架和多ATP靶向的适配体链组成。当BHQ2修饰的短链被ATP分子取代时，则ATP-DNS转换为激活状态，发出红色荧光。通过AFM检测了ATP-DNS的整体完整性，显示了预期的四面体形态作为对照，设计了cy3修饰的ATP适配体链与bhq2修饰的长配体链。这种纳米结构不能被ATP分子取代，一直保持猝灭状态，称为DNC。ATP-DNS和DNC对ATP的不同荧光光谱表明，ATPDNS对ATP的反应很敏感，而DNS则不敏感（图4）。为了进一步验证ATPDNS对ATP的特异性识别，ATPDNS和DNC的荧光强度用添加ATP进行测量。如图4c所示，ATP-dns的荧光强度随着ATP的增加而成比例地增强，而DNC没有荧光信号。这些现象表明，ATPDNS能够特异性地识别ATP。ATP-DNS和DNC的不同分子构型。与ATP相比，添加了CTP、UTP或GTP的ATP-DNS发出的荧光强度较小(图4d)，证明了ATP-DNS对识别ATP的高选择性。因此ATP-DNS的合成具有四面体构型，并具有识别ATP的特异性。在验证ATP-DNS的构建和功能后，对活细胞（A549和H1975细胞）进行ATP-DNS对细胞内ATP的实时监测。A549细胞与ATP-DNS孵育显示有明显的红色荧光，而与IAA无荧光抑制此外，通过溶酶体染色（绿色荧光）进一步研究了ATP-DNS在细胞内的位置。这些现象说明了ATP-DNS具有较高的膜穿透率和较高的特异性识别ATP。在与ATP-DNS孵育的H1975细胞中也表现出类似的现象。为了量化以活细胞为基础的药物反应试验中ATP的变化，收集了用不同药物处理的两种细胞的荧光强度。基于化疗药物治疗野生型EGFR细胞，奥西替尼治疗突变EGFR细胞的临床治疗，将A549和H1975细胞分别暴露于相关药物，ATP-DNS监测48h。在培美曲塞和卡铂分别处理下，A549细胞中ATP的变化较对照组持续下降，而在卡铂处理的细胞中下降更明显。ATP-DNS监测的ATP的变化可以反映不同类型和浓度的药物对两种细胞的不同抑制作用。为了验证ATP-DNS监测ATP的准确性，分别用商业试剂盒检测了经药物处理后48 h的两种细胞的ATP含量和细胞活力。检测到的A549和H1975细胞的存活率与ATP-DNS和ATP检测试剂盒检测到的ATP变化趋势一致。这些定量结果表明，ATP-DNS具有一种准确的定量功能，可实时监测细胞中不同的药物反应分析，显示与商业试剂盒100%一致。简而言之，ATP-DNS能够实时准确地监测ATP的变化，而不是被限制在单个时间点。基于ATP-DNS，可以在RDMO-Chip上实现对活细胞全程药物反应的监测。  图4：ATP-DNS的表征和功能验证。 通过临床样本验证RDMO芯片：RDMO-Chip通过来自NSCLC患者的细胞系和临床样本进行了验证。为了快速检测EGFR突变的存在，从临床组织捕获样本中分离出来的细胞，用EGFR-DNR染色并进行荧光成像(图5)。2个临床样本中EGFR-DNR-25的绿色荧光强度均强于EGFR-DNR-100，说明2个临床样本均存在EGFR突变。在RDMO-Chip中也检测了A549和H1975细胞，以排除PDMS对荧光想象的影响。为了进行抗癌药物反应试验，来自患者1和患者2的癌细胞在2个RDMO-Chips中培养7-10天，形成PDOs。采用奥西替尼作为一线药物，在PDO构建成功后立即加入RDMO-Chips中，所有PDOs均用ATP-DNS染色并进行荧光成像。每3天一次，监测期为9天，直到大部分pdo被杀死。没有观察到有IAA抑制的荧光，表明ATP-DNS可以识别PDOs的细胞内ATP。仅在一个时间点提供ATP数量，ATP-DNS提供了绘制反映ATP数量和相应PDOs生长状态的曲线的能力。对于患者1，奥西替尼从第3天到第9天均能有效抑制PDO的生长。在这种情况下，选择较低的药物浓度可能是患者1更好的解决方案，以减少奥西替尼的副作用。对于患者2，奥西替尼（40 nM）与奥西替尼（20 nM）相比，表现出更好的抑制效果。因此，选择较高的药物浓度应是首选药物，以确保治疗效果。此外，我们还对患者1和患者2的PDO形态学也进行了成像。对形态的观察结果是相同的。  图 5：RDMO-芯片上的快速EGFR突变检测和基于类器官的药物反应监测。 使用ATP-DNS的定性PDO增长趋势。然而，直接观察PDO的形态并无法量化抑制效果，这对于准确区分药物对个体患者的影响很重要，如本研究中的患者2。为了证明RDMO-Chip在混合化疗药物测试中的能力，我们使用了培美曲塞和卡铂。既往研究表明，不同化疗药物联合给药比单独使用具有更好的治疗效果。然而，不同药物的浓度比仍取决于医生的经验和主观意见。在这个探索最佳药物组合的概念验证试验中，比例混合模式组类器官室暴露于不同浓度比的培美曲塞和卡铂。如图6所示，对于患者1，3种药物组合（P：C = 0：3、1：3、3：0）表现出类似的PDO抑制作用，而其余1种药物组合（P ：C = 3：1）的抑制作用相对较弱。对于患者2 ，一种药物组合（P：C = 3：1）的表现优于其他3种药物组合。这些结果为医生选择最佳的用药方案提供了有用的参考。简而言之，RDMO-Chip确保在2小时内快速检测EGFR突变的存在，并通过监测细胞内ATP变异提供PDOs上抗癌药物的定量评价，为指导个性化肺癌药物提供了可行的新策略。根据临床要求，易于调节类器官腔室的数量和比例混合设计。  图 6：培美曲塞和卡铂的不同组合的基于PDO的药物反应。 总结 本研究展示了一种双功能微流控芯片，用于快速检测EGFR突变，并全程监测类器官RDMO芯片上的药物反应。这个芯片有以下技术优势：使用EGFR-DNR缩短检测EGFR突变的时间成本，有目的性地测试抗癌药物；使用新型ATP-DNS识别细胞内ATP变异，而不损害细胞活力，实现对类器官整个过程生长状态的原位监测，用于片上药物反应试验；所有操作程序一个芯片中和设备中完成，避免了在不同设备之间转移过程中带来的癌细胞组织样本人为丢失。通过临床样本的验证分析表明，RDMO-Chip结合EGFR突变检测和基于器官的药物反应测试，以指导个性化肺癌药物筛选，是一种可行的解决方案。此外，基于双功能微流控芯片，开发了一个自动化芯片操作过程的系统，跨越了实验程序和治疗方法之间的鸿沟。 论文链接：DOI: 10.1039/d3lc00974b 原创：“扬清芯片” 前沿资讯 扬清芯片”前沿资讯“专题将于每周一为行业内相关从业者提供最新的行业资讯。往期精彩合集可在菜单栏"前沿资讯”查看。 欢迎将文章与公众号分享给更多关注微流控行业的朋友！ |
