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图解微流控｜第36期Issuing time:2022-02-25 10:32 微流控芯片实验室在离子和小分子研究中的应用（一） 微流控芯片不仅在以蛋白质、核酸等生物大分子为对象的研究中显示了操作单元规模集成，灵活组合的优势，其在离子和分子量在1000以下的小分子的分离分析乃至合成方面的发展潜力也不容忽视。本章将从阴阳离子，手性分子以及代谢相关小分子三个方面介绍微流控芯片在离子和小分子研究中的基本方式和最新进展。 12.1离子 离子是原子或原子团由于得失电子而形成的带电微粒，也可看作是化合物解离后的特殊存在形式，多为无机盐类，也有一些是结构简单的有机酸碱。环境监测、食品检验和医疗诊断等均涉及离子的分离分析（表12-1），发展便携、低耗和操作简单的离子分析装置具有重要的现实意义。 表12-1 涉及离子检测的相关领域及检测方式
除少数离子能够直接检测外，多数样品中的离子组分彼此干扰，通常需经过一些分离技术如离子色谱，毛细管电泳等将各组分分离后再行检测。微流控芯片已被证明能够将毛细管电泳，色谱等分离技术平移其上，并集成过滤、富集等预处理功能，有望成为离子分析的有力工具。目前微流控芯片上已经开展了离子分离和检测的探索，预处理功能的集成则可能成为未来一段时间内的研究热点。 12.1.1 离子分析流程 微流控芯片离子分离分析一般流程如图12-1所示，现阶段多以芯片电泳作为分离手段，以电化学检测作为主要检测方式。
图12-1 微流控芯片离子分析流程 12.1.1.1 芯片材质选择 材质的选择是芯片制作的首要环节，除了考虑材质的物理化学性质、成本和制作工艺外，还需兼顾分析对象的特点。例如分析对象为无机离子时，宜选用聚合物芯片，或对玻璃芯片通道进行修饰，因为玻璃芯片表面的－Si-OH会产生离子交换吸附，可能导致峰展宽、记忆效应，并影响重现性[1]。芯片的各种材质及性能在本书第2章常用微流控芯片材料与性能中有较详细的阐述。 12.1.1.2 检测方式 检测方式不仅是影响分析对象检出限的重要因素之一，也关系到样品的前处理过程。检测方式选择一是取决于分析对象的性质，如多数无机离子没有自荧光，在紫外区没有吸收，但具有电化学响应，可以采用电化学检测，如果分析对象浓度很低，电化学检测难以检出，则可以考虑间接荧光检测或进行荧光标记；二是取决于样品中的干扰组分，以分析对象响应强，干扰组分响应弱或无响应为佳。微流控芯片检测器特点及性能详见第9章。 表12-2为微流控芯片在阴阳离子分离分析研究领域的部分文献小结，着重指出了所选用的芯片材质和检测方式以供读者参考，当然，实际应用中仍需根据检测对象作具体分析。 表12-2 微流控芯片阴阳离子分析[1]
12.1.2 离子分离模式 如前所述，离子样品往往是几种甚至多种离子的混合物。当共存离子与待测离子性质相似，或待测对象是多个离子时，通常需要经过某些分离手段将样品中的离子彼此分开再进行检测。毛细管电泳和色谱的大部分分离方式已经被微型化到微流控芯片上并用于离子分析，如图12-2所示。
图12-2 微流控芯片离子分离模式概览 12.1.2.1 区带电泳 区带电泳是一种强有力的分离技术，在离子分离分析中得到广泛应用[2-5]。图12-3所示即为区带电泳分离化学发光检测的典型模式。近来，王等建立了双向进样区带电泳使得阴离子和阳离子在同一通道内实现分离和检测[6]。
图12-3 区带电泳分离化学发光检测三种金属离子[9] (a) 芯片结构示意图，首先使通道内充满缓冲液，加化学发光试剂后，于缓冲液废液池抽真空，使化学发光试剂进入分离通道，然后加样品于样品池，在加电压上样及分离的同时对化学发光试剂池加一定高压，使化学放光试剂以稳定流速和分离通道内的液流接触，遇金属离子催化后产生发光信号；(b) 三种金属离子芯片电泳谱图 12.1.2.2 等速电泳 前已提及，等速电泳（isotachophoresis, ITP）是一种基于离子淌度差异的“移动边界”电泳技术。它采用两种不同的缓冲液系统，一种是前导电解质，充满整个芯片通道，另一种称尾随电解质，置于一端储液池，前者的淌度高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的淌度夹在中间，以一个速度移动，实现分离。等速电泳具有两个特点，一是区带尖锐化，显示出很高的分离能力，对于电泳淌度相近的离子分离适宜采用这种分离方式；二是区带浓缩，即样品组分在分离的同时得到富集，适合用于痕量分析。图12-4（a）为等速电泳分离金属离子示例。操作过程为在图（Ⅰ）所示芯片上，将前导电解质加于D池和分离通道，样品加于B池（20 μL），样品进入分离通道后，尾随电解质通过注射泵注入B池，DB两端施加电压进行等速电泳；电化学检测结果见图（Ⅱ）。图12-4（b）为双向等速电泳同时分离阴阳离子。将图（Ⅰ）所示A、C、D池经不锈钢管和四氟管与外置储液池相连，并通过电磁阀控制液流，首先在A、C池分别加不同的前导电解液，使之流向B池，再将样品由D池流向B池，最后在AC之间施加高压，则阴阳离子分别流向A池和C池，检测结果见图（Ⅱ）。
图12-4 等速电泳分离分析阴阳离子[7, 13] (a)等速电泳分离金属离子，(Ⅰ)芯片结构示意图，(Ⅱ)金属离子等速电泳分离谱图，1. Na+，2. Li+，3. La3+，4. Dy3+，5. Yb3+，6. carnitine；(b)双向等速电泳同时分离阴阳离子，(Ⅰ)双向等速电泳PMMA芯片结构及相关设备示意图，(Ⅱ)阴阳离子混合物等速电泳谱图，1.Cs＋，2.NH4＋， 3.Na＋，4.Li＋，5.BTP－，6.Cl－，7.NO3－，8.SO42－，9.F－，10.acetate 12.1.2.3等速电泳－区带电泳 等速电泳和区带电泳的结合使两种技术优势互补，避免了单一等速电泳产生的峰过于尖锐，难以定量的缺点，和区带电泳上样量小，对检测器灵敏度要求高的限制。微流控芯片设计灵活，等速电泳和区带电泳单元可在一次制作中成型，避免了毛细管实现二维电泳时制作接口的过程。等速电泳在离子分析中通常作为区带电泳分离前的上样技术，将样品压缩至一个狭窄的区带。图12-5为在微流控芯片上利用ITP-CZE技术检测多种离子示例。芯片结构如图12-5（a）所示，样品和电解质溶液均通过外置蠕动泵和阀引入通道，分离通道1和2的末端各设置一个铂电极的电导检测器用于监测等速电泳和区带电泳结果。研究人员在此芯片上对白酒样品（20倍稀释直接上样）中有机酸和无机阴离子进行了分离分析，结果见图12-5（b）。
图12-5 微流控芯片等速电泳偶联区带电泳检测酒中有机酸和无机阴离子[14] (a) 等速电泳－区带电泳芯片结构示意图；(b) 白酒样品（20倍稀释）中有机酸和无机阴离子分离分析电泳谱图，3. phosphate，4.malonate，5.tartrate，6.citrate，7.malate，8.lactate，9.gluconate， 10.aspartate，11.succinate 12.1.2.4 离子色谱 离子色谱是以低交换容量的离子交换树脂为固定相对离子性物质进行分离，用电导检测器连续检测流出物电导变化的一种色谱方法[15]，是分析无机阴阳离子的首选，尤其适合复杂基体中的阴离子分析。随着技术的日臻完善，目前吸收光度，荧光等其他检测方式也可以用于离子色谱。制备离子交换柱的方法包括制作填充柱[16]、整体柱[17]和表面涂层[18]等。通过微流控芯片实现离子色谱微型化的报道很少，主要困难在于固定相的引入[19]。图12-6为微流控芯片离子色谱分离无机阴离子示例。
图12-6 离子色谱分离无机阴离子[19] (a) 芯片离子色谱实物图，芯片由硅片和玻璃封接而成，出口用毛细管和外置微泵及检测器相连，通过20 nL微量进样器手动上样；(b) 阳离子型乳胶纳米粒子吸附于硅片通道表面形成固定相示意图；(c) 毛细管离子色谱(Ⅰ)和芯片离子色谱(Ⅱ)分离无机阴离子色谱图，1.thiourea，2.NO2-，3.I- 参考文献  文章来源：《图解微流控芯片实验室》林炳承、秦建华 著 为进一步推广普及微流控芯片技术，霆科生物获得林炳承先生授权，公司网站及公众号开辟“图解微流控”专版，连载《图解微流控芯片实验室》一书的主要内容。 本版刊登内容仅限于学术交流，严禁用于任何商业用途。 欢迎转发分享，如需转载请与我们联系，谢谢！ |
